技术领域
[0001] 本
发明属于农业技术领域，尤其是一种降低褐化提高农杆菌介导蓖麻遗传转化率的方法。
背景技术
[0002] 蓖麻又称红麻、大麻子等，为世界十大油料作物之一。蓖麻籽高含油率和独特的油脂组成已成为广为重视的
生物能源植物和特色精细化工原料，广泛应用于航空、航天、
汽车和高速机床(生物
润滑油)、纺织业印染、
农药助剂、医药用药剂等领域。中国是蓖麻种植面积和
蓖麻油用量均较大的国家，但由于缺乏适应性广的蓖麻品种，蓖麻的单位面积产量参差不齐，种植的蓖麻籽不能满足需要，每年蓖麻籽(油)尚需进口。传统的杂交育种速度不能满足需求，生物育种，尤其是遗传转化育种是蓖麻育种的方向之一，其中，农杆菌介导植物遗传转化是首选，但不同植物的遗传转化效率相差较大，蓖麻属于较难通过农杆菌介导植物遗传转化的物种之一，主要是物种本身的遗传特性决定，技术上还存在如外植体及培养物污染、
玻璃化、褐化现象等问题，使转化效率较低。玻璃化的成因主要有
激素浓度、培养基成分、光、温、湿及透气性等，玻璃化植物组织中
含水量高，干物质、叶绿素、
蛋白质等含量低、
角质层、栅栏组织等发育不全。
纤维化和
纤维素含量低是玻璃化植物组织的一个重要特点。
[0003] 通过检索，尚未发现与本发明
专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
[0004] 本发明目的在于克服
现有技术中的不足之处，提供一种降低褐化提高农杆菌介导蓖麻遗传转化率的方法，该方法通过外植体预培养、改变添加
硫代硫酸钠浓度和使用方法等技术降低褐化率和提高蓖麻的遗传转化率。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006] 一种降低褐化提高农杆菌介导蓖麻遗传转化率的方法，所述方法中在外植体的选择上，采用
种子预培养获得生长胚，剥离预培养的胚进一步预培养获得膨大成熟的胚，再从膨大成熟的胚上取胚轴作外植体；所述方法中采用硫代硫酸钠防止外植体褐化。
[0007] 而且，所述硫代硫酸钠的添加方式如下：
[0008] 先在蓖麻遗传转化中加入硫代硫酸钠来防止外植体褐化；在外植体种子预培养和剥离胚的预培养基中加入低浓度硫代硫酸钠；在蓖麻遗传转化开始的共培养用培养基以及转化过程中的胚性细胞培养和芽诱导培养用培养基中均加入硫代硫酸钠。
[0009] 而且，具体步骤如下：
[0010] ⑴种子消毒
[0011] 用解剖刀扎入种子，然后，向外掀开种皮，剥去皮；剥好种皮后进行消毒；种子消毒过程为无菌水水洗1.5min，75％
乙醇灭菌45s，再无菌水水洗3次，各1.5min；再用1.2％
次氯酸钠在100r/min条件下振荡浸泡灭菌8min，最后用无菌水水洗5次，每次1.5min；
[0012] ⑵种子预培养
[0013] 消毒后的种子移到1/2MS培养基外加0.5mmol/L的硫代硫酸钠的种子培养基中培养，培养
温度为25℃，光照500Lx，待种子露白后待用；
[0014] ⑶胚的剥离
[0015] 用带有尖刀片的解剖刀扎入种子底部，然后向外掀开一个裂口，撵动种皮，使种皮开裂、裂口变大，在不破坏内种皮的前提下，剥离外种皮；将剥好的种子置于纸巾或干净的培养皿中；全部剥好后，准备消毒；
[0016] ⑷胚的剥离及预培养
[0017] 无菌状态下将经过预培养的蓖麻种子，在蓖麻籽有明显黑色斑点的一端用12号解剖刀，从无斑点端1/2处沿
中轴线纵切种子，使其一分为二，将胚挑出；
[0018] 将挑出的种胚接种于外加0.5mmol/L硫代硫酸钠的预培养基中；将已接种的培养基放置于24℃黑暗环境下培养5-8d；期间注意观察褐变情况；如发现外植体有褐变倾向，即
颜色由白变深，立即转移至新的培养基中；
[0019] ⑸蓖麻农杆菌侵染共培养
[0020] ①制备农杆菌
[0021] 取农杆菌，放入加有抗生素的LB液体培养基中，农杆菌：LB液体培养基的比例μL：mL为10：1，244r/min培养过夜；农杆菌生长至OD值0.8-1.0时取菌液，倒入加有抗生素的LB液体培养基中，菌液：LB液体培养基的体积比为1：250；农杆菌扩增培养生长至OD值0.5-0.7时取出，3000r/min离心15min，倒掉上清液，用农杆菌冲悬液冲悬，扩增培养后的菌液：农杆菌冲悬液的体积比为1：1，使菌体充分悬浮；
[0022] ②胚尖的剥离
[0023] 取培养好的蓖麻胚，仔细观察胚轴
位置，去除外植体的胚根及子叶，保留胚轴，然后置于无菌的培养皿中等待农杆菌侵染；
[0024] ③侵染及共培养
[0025] 将剥出来的胚轴一次性倒入农杆菌悬浮液中，50r/min培养10min；将冲悬液倒净；
[0026] 将胚轴放置于垫有无菌
滤纸的培养皿上，覆上几张滤纸，擦干菌液；将其放入外加0.25mmol/L硫代硫酸钠的共培养基中，25℃黑暗培养5d；
[0027] ⑹冲洗外植体和愈伤组织培养
[0028] 将农杆菌侵染后的蓖麻外植体从共培养基中取出，置于垫有滤纸的培养皿上；覆上滤纸吸干外植体上残余物质，每次一板，每板换一次
镊子；如若农杆菌生长过快，夹紧外植体并在共培培养基表面擦拭，将附带的农杆菌清理干净，再放在滤纸上；将干燥后的蓖麻外植体夹入另一个垫有滤纸的培养皿中，等待冲洗；将外植体放入锥形瓶，先用3-5倍体积的含有400mg/mL Cefo(头孢霉素)的1/2MS液体培养基清洗外植体表面菌液及培养基残余物质，冲洗4次，每次2min，再用1/2MS液体培养基冲洗3min；倒净锥形瓶中的液体，将外植体倒至垫有滤纸的培养皿上，覆上2-3张滤纸吸干外植体上残余物质，再将一部分外植体转移至另一个垫有滤纸的培养皿上，重复上述操作；夹取外植体，置于外加0.25mmol/L硫代硫酸钠的愈伤组织培养基中；每板10个外植体，每板换一个镊子；
[0029] ⑺胚性细胞培养和芽诱导培养
[0030] 对愈伤组织培养12-15d，部分外植体开始有芽产生；出芽的愈伤组织放于芽诱导培养基中使芽生长，未出芽的愈伤组织15d更换新的外加0.25mmol/L硫代硫酸钠的愈伤组织培养基；
[0031] 将0.5cm以上的芽取下后垂直插入含有生根培养基的组培瓶中，当外植体主茎长度超过1.5cm时，将芽垂直插入组培瓶中，每瓶1棵；组培瓶培养基外加0.25mmol/L硫代硫酸钠；7-10d更新1次培养基；等待出根；
[0032] ⑻炼苗和移土栽培
[0033] 当发现外植体诱导出根，最长根长至2-3cm后打开瓶盖，进行炼苗；炼苗4-6d后移至
土壤中，
压实土壤；移栽到土壤里的
幼苗以长出2-3片新叶为存活标准，当确认存活后从
培养箱移至恒
温室中，进行2-3d生长后再移到室外大棚或大田培养；
[0034] ⑼转化植株的遗传鉴定
[0035] 根据转化用质粒中启动子和基因，从启动子后部10-15个
碱基开始合成正向引物，从转化基因后部向前合成反向引物；提取转化植物
叶片DNA，用PCR的方法鉴定转化植株是否为阳性植株。
[0036] 而且，所述步骤⑷中预培养基为：MS固体培养基+终浓度0.88μmol/L细胞分裂素；
[0037] 或者，所述步骤⑸①中农杆菌冲悬液为：pH＝5.8，1/2MS液体培养基+终浓度20g/L
蔗糖+终浓度200μmol/L乙酰丁香
酮(AS)+终浓度1mmol/L亚精胺(SPD)；
[0038] 或者，所述步骤⑸③中共培养基为：MS固体培养基+终浓度0.88μmol/L 6-BA(细胞分裂素)+终浓度200μmol/LAS(乙酰丁香酮)；
[0039] 或者，所述步骤⑹中愈伤组织培养基为MS固体培养基+终浓度0.88μmol/L 6-BA(细胞分裂素)+终浓度0.2mg/mL IBA(吲哚丁酸)+终浓度400mg/L头孢噻肟；
[0040] 或者，所述步骤⑺中芽诱导培养基为MS固体培养基+终浓度2.22μmol/L 6-BA(细胞分裂素)+终浓度0.2mg/mL IBA(吲哚丁酸)+终浓度400mg/L头孢噻肟；
[0041] 或者，所述步骤⑺中生根培养基为1/2MS固体培养基+终浓度0.5mg/mL IBA(吲哚丁酸)。
[0042] 而且，所述步骤⑼中启动子为35S启动子，基因序列为FAH12，即ID8267537。
[0043] 本发明取得的优点和积极效果为：
[0044] 1、本发明方法通过外植体预培养、改变添加硫代硫酸钠浓度和使用方法等技术降低褐化率和提高蓖麻的遗传转化率，在大豆等遗传转化时在共培养基中加入硫代硫酸钠，能较好防止外植体褐化，该方法防止褐化所用药剂单一，使用方便，能够大大降低褐化率，从而提高蓖麻转基因遗传转化率。
[0045] 2、本发明方法在外植体的选择上，采用种子预培养获得生长胚，剥离预培养的胚进一步预培养获得膨大成熟的胚，再从膨大成熟的胚上取胚轴作外植体。利用成熟的胚做外植体，能有效降低分化芽的玻璃化率，其原因是蓖麻成熟胚与未成熟胚比，组织中含水量低，纤维化和纤维素含量高，干物质含量高，蛋白质等营养物质丰富，能有效降低玻璃化率和提高蓖麻的遗传转化率。
[0046] 3、本发明方法在利用硫代硫酸钠防止外植体褐化技术上，与现有技术不同的是：
[0047] (1)先在蓖麻遗传转化中加入硫代硫酸钠来防止外植体褐化；(2)在外植体种子预培养和剥离胚的预培养基中加入低浓度硫代硫酸钠。(3)在蓖麻遗传转化开始的共培养用培养基以及转化过程中的胚性细胞培养和芽诱导培养用培养基中均加入硫代硫酸钠，但均降低了使用浓度。该方法能降低蓖麻转化的褐化率，也因为低浓度硫代硫酸钠能降低其对愈伤组织和农杆菌侵染的影响，可有效降低褐化率和提高蓖麻的遗传转化率。
具体实施方式
[0048] 下面详细叙述本发明的
实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0049] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0050] 一种降低褐化提高农杆菌介导蓖麻遗传转化率的方法，所述方法中在外植体的选择上，采用种子预培养获得生长胚，剥离预培养的胚进一步预培养获得膨大成熟的胚，再从膨大成熟的胚上取胚轴作外植体；所述方法中采用硫代硫酸钠防止外植体褐化。
[0051] 较优地，所述硫代硫酸钠的添加方式如下：
[0052] 先在蓖麻遗传转化中加入硫代硫酸钠来防止外植体褐化；在外植体种子预培养和剥离胚的预培养基中加入低浓度硫代硫酸钠；在蓖麻遗传转化开始的共培养用培养基以及转化过程中的胚性细胞培养和芽诱导培养用培养基中均加入硫代硫酸钠。
[0053] 较优地，具体步骤如下：
[0054] ⑴种子消毒
[0055] 用解剖刀扎入种子，然后，向外掀开种皮，剥去皮；剥好种皮后进行消毒；种子消毒过程为无菌水水洗1.5min，75％乙醇灭菌45s，再无菌水水洗3次，各1.5min；再用1.2％次氯酸钠在100r/min条件下振荡浸泡灭菌8min，最后用无菌水水洗5次，每次1.5min；
[0056] ⑵种子预培养
[0057] 消毒后的种子移到1/2MS培养基外加0.5mmol/L的硫代硫酸钠的种子培养基中培养，培养温度为25℃，光照500Lx，待种子露白后待用；
[0058] ⑶胚的剥离
[0059] 用带有尖刀片的解剖刀扎入种子底部，然后向外掀开一个裂口，撵动种皮，使种皮开裂、裂口变大，在不破坏内种皮的前提下，剥离外种皮；将剥好的种子置于纸巾或干净的培养皿中；全部剥好后，准备消毒；
[0060] ⑷胚的剥离及预培养
[0061] 无菌状态下将经过预培养的蓖麻种子，在蓖麻籽有明显黑色斑点的一端用12号解剖刀，从无斑点端1/2处沿中轴线纵切种子，使其一分为二，将胚挑出；
[0062] 将挑出的种胚接种于外加0.5mmol/L硫代硫酸钠的预培养基中；将已接种的培养基放置于24℃黑暗环境下培养5-8d；期间注意观察褐变情况；如发现外植体有褐变倾向，即颜色由白变深，立即转移至新的培养基中；
[0063] ⑸蓖麻农杆菌侵染共培养
[0064] ①制备农杆菌
[0065] 取农杆菌，放入加有抗生素的LB液体培养基中，农杆菌：LB液体培养基的比例μL：mL为10：1，244r/min培养过夜；农杆菌生长至OD值0.8-1.0时取菌液，倒入加有抗生素的LB液体培养基中，菌液：LB液体培养基的体积比为1：250；农杆菌扩增培养生长至OD值0.5-0.7时取出，3000r/min离心15min，倒掉上清液，用农杆菌冲悬液冲悬，扩增培养后的菌液：农杆菌冲悬液的体积比为1：1，使菌体充分悬浮；
[0066] ②胚尖的剥离
[0067] 取培养好的蓖麻胚，仔细观察胚轴位置，去除外植体的胚根及子叶，保留胚轴，然后置于无菌的培养皿中等待农杆菌侵染；
[0068] ③侵染及共培养
[0069] 将剥出来的胚轴一次性倒入农杆菌悬浮液中，50r/min培养10min；将冲悬液倒净；
[0070] 将胚轴放置于垫有无菌滤纸的培养皿上，覆上几张滤纸，擦干菌液；将其放入外加0.25mmol/L硫代硫酸钠的共培养基中，25℃黑暗培养5d；
[0071] ⑹冲洗外植体和愈伤组织培养
[0072] 将农杆菌侵染后的蓖麻外植体从共培养基中取出，置于垫有滤纸的培养皿上；覆上滤纸吸干外植体上残余物质，每次一板，每板换一次镊子；如若农杆菌生长过快，夹紧外植体并在共培培养基表面擦拭，将附带的农杆菌清理干净，再放在滤纸上；将干燥后的蓖麻外植体夹入另一个垫有滤纸的培养皿中，等待冲洗；将外植体放入锥形瓶，先用3-5倍体积的含有400mg/mL Cefo(头孢霉素)的1/2MS液体培养基清洗外植体表面菌液及培养基残余物质，冲洗4次，每次2min，再用1/2MS液体培养基冲洗3min；倒净锥形瓶中的液体，将外植体倒至垫有滤纸的培养皿上，覆上2-3张滤纸吸干外植体上残余物质，再将一部分外植体转移至另一个垫有滤纸的培养皿上，重复上述操作；夹取外植体，置于外加0.25mmol/L硫代硫酸钠的愈伤组织培养基中；每板10个外植体，每板换一个镊子；
[0073] ⑺胚性细胞培养和芽诱导培养
[0074] 对愈伤组织培养12-15d，部分外植体开始有芽产生；出芽的愈伤组织放于芽诱导培养基中使芽生长，未出芽的愈伤组织15d更换新的外加0.25mmol/L硫代硫酸钠的愈伤组织培养基；
[0075] 将0.5cm以上的芽取下后垂直插入含有生根培养基的组培瓶中，当外植体主茎长度超过1.5cm时，将芽垂直插入组培瓶中，每瓶1棵；组培瓶培养基外加0.25mmol/L硫代硫酸钠；7-10d更新1次培养基；等待出根；
[0076] ⑻炼苗和移土栽培
[0077] 当发现外植体诱导出根，最长根长至2-3cm后打开瓶盖，进行炼苗；炼苗4-6d后移至土壤中，压实土壤；移栽到土壤里的幼苗以长出2-3片新叶为存活标准，当确认存活后从培养箱移至恒温室中，进行2-3d生长后再移到室外大棚或大田培养；
[0078] ⑼转化植株的遗传鉴定
[0079] 根据转化用质粒中启动子和基因，从启动子后部10-15个碱基开始合成正向引物，从转化基因后部向前合成反向引物；提取转化植物叶片DNA，用PCR的方法鉴定转化植株是否为阳性植株。
[0080] 较优地，所述步骤⑷中预培养基为：MS固体培养基+终浓度0.88μmol/L细胞分裂素；
[0081] 或者，所述步骤⑸①中农杆菌冲悬液为：pH＝5.8，1/2MS液体培养基+终浓度20g/L蔗糖+终浓度200μmol/L乙酰丁香酮(AS)+终浓度1mmol/L亚精胺(SPD)；
[0082] 或者，所述步骤⑸③中共培养基为：MS固体培养基+终浓度0.88μmol/L 6-BA(细胞分裂素)+终浓度200μmol/LAS(乙酰丁香酮)；
[0083] 或者，所述步骤⑹中愈伤组织培养基为MS固体培养基+终浓度0.88μmol/L 6-BA(细胞分裂素)+终浓度0.2mg/mL IBA(吲哚丁酸)+终浓度400mg/L头孢噻肟；
[0084] 或者，所述步骤⑺中芽诱导培养基为MS固体培养基+终浓度2.22μmol/L 6-BA(细胞分裂素)+终浓度0.2mg/mL IBA(吲哚丁酸)+终浓度400mg/L头孢噻肟；
[0085] 或者，所述步骤⑺中生根培养基为1/2MS固体培养基+终浓度0.5mg/mL IBA(吲哚丁酸)。
[0086] 较优地，所述步骤⑼中启动子为35S启动子，基因序列为FAH12，即ID8267537。
[0087] 更为具体地，一种降低褐化提高农杆菌介导蓖麻遗传转化率的方法，相关步骤如下：
[0088] 1.1种子消毒
[0089] 用解剖刀小心扎入种子，然后，向外掀开种皮，剥去皮。剥好种子后，倒入锥形瓶中，准备消毒。种子消毒过程为无菌水水洗1.5min，75％乙醇灭菌45s，再无菌水水洗3次，各1.5min。再用1.2％次氯酸钠在100r/min条件下振荡浸泡灭菌8min，最后用无菌水水洗5次，每次1.5min。
[0090] 1.2种子预培养
[0091] 消毒后的种子移到1/2MS外加0.5mmol/L的硫代硫酸钠种子培养基中培养，培养温度为25℃，弱光照，待种子露白后待用。
[0092] 1.3胚的剥离
[0093] 用带有尖刀片的解剖刀小心扎入种子底部，然后向外掀开一个小裂口，轻轻撵动种皮，使种皮开裂、裂口变大，在尽量不破坏内种皮的前提下，剥离外种皮。将剥好的种子，置于纸巾或干净的培养皿中。全部剥好后，倒入锥形瓶中，准备消毒。
[0094] 1.4胚的剥离及预培养
[0095] 无菌状态下持一颗经过预培养的蓖麻种子，在蓖麻籽有明显黑色斑点的一端用12号解剖刀，以无斑点端1/2处沿中轴线纵切种子，使其一分为二，将胚轻轻挑出。
[0096] 将挑出的种胚接种于1/2MS外加0.5mmol/L硫代硫酸钠预培养基中。将已接种的培养基放置于24℃黑暗环境下培养5-8d。期间注意观察褐变情况。如发现较重的褐变，立即转移至新的培养基中。
[0097] 1.5蓖麻农杆菌侵染共培养
[0098] 1.5.1制备农杆菌
[0099] 取20μL农杆菌，放入2mL加有抗生素的LB液体培养基中，244r/min培养过夜。农杆菌生长至OD值0.8-1.0时取2mL菌液，倒入500mL加有抗生素的LB液体培养基中。农杆菌扩增培养生长至OD值0.5-0.7时取出，装入50mL离心管，3000r/min离心15min，倒掉上清液，用50mL农杆菌冲悬液冲悬，使菌体充分悬浮。
[0100] 1.5.2胚尖的剥离
[0101] 取培养好的蓖麻胚，仔细观察胚轴位置，去除外植体的胚根及子叶，保留胚轴，然后置于无菌的培养皿中等待农杆菌侵染。
[0102] 1.5.3侵染及共培养
[0103] 将剥出来的胚轴一次性倒入农杆菌悬浮液中，50r/min培养10min。将冲悬液倒净。
[0104] 将胚轴放置于垫有无菌滤纸的培养皿上，覆上几张滤纸，轻轻擦干菌液。将其放入外加0.25mmol/L硫代硫酸钠的共培养基中，25℃黑暗培养5d。
[0105] 1.6冲洗外植体和愈伤组织培养
[0106] 将农杆菌侵染后的蓖麻外植体从共培养基中取出，置于垫有滤纸的培养皿上。覆上滤纸轻轻撵动，吸干外植体上残余物质，每次一板，每板换一次镊子。如若农杆菌生长过快，可夹紧外植体并在共培培养基表面擦拭，将附带的农杆菌清理干净，再放在滤纸上。将干燥后的蓖麻外植体夹入另一个垫有滤纸的培养皿中，等待冲洗。将外植体放入锥形瓶，先用头孢冲洗4次，每次2min，再用1/2MS液体培养基冲洗3min。倒净锥形瓶中的液体，将外植体倒至垫有滤纸的培养皿上，覆上2-3张滤纸轻轻撵动，再将一部分外植体转移至另一个垫有滤纸的培养皿上，重复上述操作。夹取外植体，置于外加0.25mmol/L硫代硫酸钠的愈伤组织培养基中。每板10个外植体，每板换一个镊子。
[0107] 1.7胚性细胞培养和芽诱导培养
[0108] 对愈伤组织培养12-15d，部分外植体开始有芽产生。出芽的愈伤组织放于芽诱导培养基中使芽生长，未出芽的愈伤组织15d更换新的外加0.25mmol/L硫代硫酸钠的愈伤组织培养基。
[0109] 将0.5cm以上的芽取下后垂直插入含有生根培养基的组培瓶中，当外植体主茎长度超过1.5cm时，将芽垂直插入组培瓶中，每瓶1棵。组培瓶培养基外加0.25mmol/L硫代硫酸钠。7-10d更新1次培养基。等待出根。
[0110] 1.8炼苗和移土栽培
[0111] 当发现外植体诱导出根，最长根长至2-3cm后打开瓶盖，进行炼苗。炼苗4-6d后移至土壤中，压实土壤。移栽到土壤里的幼苗以长出2-3片新叶为存活标准，当确认存活后可以从培养箱移至恒温室中，进行2-3d生长后再移到室外大棚或大田培养。
[0112] 1.9转化植株的遗传鉴定
[0113] 根据转化用质粒中启动子和基因，从启动子后部10-15个碱基开始合成正向引物，从转化基因后部向前合成反向引物。提取转化植物叶片DNA，用PCR的方法鉴定转化植株是否为阳性植株。
[0114] 本发明的相关验证及结果：
[0115] 一、不同蓖麻外植体遗传转化
[0116] 以天蓖26为实验材料，分别以预培养剥离胚再次预培养胚的胚轴、完整的胚以及子叶节作为蓖麻组培的外植体，对蓖麻进行组织培养，并且都使用农杆菌介导法进行转化。过程中为减少褐化，在所有涉及到的固体培养基中加入0.5mmol/L浓度的硫代硫酸钠。除外植体不同外，其它实验操作完全相同，试验分3个重复进行，每次重复各为30个外植体。得到以下褐化率和转化率。
[0117] 外植体 褐化率(％) 分化芽的玻璃化率(％) 再生植株的玻璃化率(％) 转化率(％)胚轴 8 11.5 8.5 26.0完整的胚 14.1 14.6 8.6 16.4
子叶节 15.2 15.7 8.9 14.4
[0118] 从数据看出，以蓖麻胚轴作为外植体更为合适，结合文献，证明胚轴是最合适的外植体，褐化率为8.0％，转化率达26.0％。
[0119] 二、不同成熟度胚作外植体的遗传转化
[0120] 以天蓖26为实验材料，分别以种子胚、预培养种子胚，种子预培养剥离胚再次预培养胚的胚轴作外植体，对蓖麻进行组织培养，并且都使用农杆菌介导法进行转化。为减少褐变，在所有涉及到的固体培养基中加入0.5mmol/L浓度的硫代硫酸钠。除外植体不同外，其它实验操作完全相同，试验分3个重复进行，每次重复各为30个外植体。得到以下玻璃化率和转化率。
[0121]
[0122] 以上结果说明，分别以种子胚、预培养种子胚，种子预培养剥离胚再次预培养胚的胚轴作外植体，对蓖麻进行组织培养。相比于以种子胚、预培养种子胚作外植体，以种子预培养剥离胚再次预培养胚的胚轴(成熟胚)作外植体可以降低褐化率和分化芽的玻璃化率，同时大幅度提高转化率。
[0123] 三、硫代硫酸钠应用于不同培养基的遗传转化效果
[0124] 遗传转化不同过程中使用不同的培养基，硫代硫酸钠在不同培养基上使用的效果不同。本试验以胚轴作为外植体，将相同浓度的硫代硫酸钠(0.5mmol/L)只加入到预培养基、共培养基、愈伤组织培养基、生根培养基中的一种培养基中作为4个对照，以所有培养基均加硫代硫酸钠为处理。试验分3个重复进行，每次重复为各30个外植体。得到以下褐化率和转化率。
[0125]硫代硫酸钠添加方式 硫代硫酸钠浓度(mmol/L) 褐化率(％) 转化率(％)预培养培养基 0.5 8.9 28
共培养培养基 0.5 10.9 16.5
愈伤组织培养基 0.5 11.1 16.1
生根培养基 0.5 11.2 16.9
上述4种培养基均加 0.5 8 26
[0126] 以上结果说明，在每一步培养的培养基中，只要加入硫代硫酸钠，均可以降低褐化率，从而提高遗传转化率。其中加入到预培养过程的培养基中效果优于加入到共培养培养基、愈伤组织培养基和生根培养基。预示后面3种培养基中硫代硫酸钠的浓度可能太高，从而影响组织的分化和生长。
[0127] 四、不同培养基硫代硫酸钠浓度对遗传转化效果的影响
[0128] 本试验以胚轴作为外植体，将不同浓度的硫代硫酸钠均加入到预培养基、共培养基、愈伤组织培养基、生根培养基中。以所有培养基均加0.5mmol/L硫代硫酸钠作为对照。试验分3个重复进行，每次重复为各30个外植体。得到以下褐化率和转化率。
[0129]
[0130] 以上结果说明，保持预培养的培养基中较高浓度的硫代硫酸钠，降低共培养培养基、愈伤组织培养基和生根培养基硫代硫酸钠的浓度更有利于降低褐化率，从而提高转化率。
[0131] 五、不同培养基硫代硫酸钠浓度对遗传转化效果的影响
[0132] 本试验以胚轴作为外植体，将不同浓度的硫代硫酸钠均加入到预培养基、共培养基、愈伤组织培养基、生根培养基中。以所有培养基均加0.5mmol/L硫代硫酸钠作为对照。试验分3个重复进行，每次重复为各30个外植体。得到以下褐化率和转化率。
[0133]
[0134] 以上结果说明，降低预培养的培养基中较高浓度的硫代硫酸钠，保持共培养培养基、愈伤组织培养基和生根培养基中较高浓度的硫代硫酸钠，虽然也能较有效地降低褐化率，但转化率并没有相应地提高，分析原因可能是较高浓度的硫代硫酸钠不利于外植体的分化和生长。
[0135] 六、培养基低浓度硫代硫酸钠浓度对遗传转化效果的影响
[0136] 本试验以胚轴作为外植体，将相同浓度的硫代硫酸钠均加入到预培养基、共培养基、愈伤组织培养基、生根培养基中。所有培养基的硫代硫酸钠浓度为0.25mmol/L，以所有培养基均加0.5mmol/L硫代硫酸钠作为对照。试验分3个重复进行，每次重复为各30个外植体。得到以下褐化率和转化率。
[0137]
[0138] 以上结果说明，降低预培养培养基、共培养培养基、愈伤组织培养基和生根培养基的硫代硫酸钠浓度，不能非常有效地降低褐化率和提高遗传转化率。
[0139] 尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附
权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和
修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
