一种筛选高表达外源蛋白的非整合减毒李斯特菌菌株的方法
阅读：894发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种筛选高表达外源蛋白的非整合减毒李斯特菌菌株的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及一种筛选高表达外源蛋白的非整合减毒李斯特菌菌株的方法。具体来说，本公开涉及一种检测由非整合的减毒李斯特菌所表达的外源蛋白的量的方法，一种筛选非整合的减毒李斯特菌的方法和依据上述筛选方法得到的非整合的减毒李斯特菌。本公开采用的方法耗时短、操作简洁、样品检测量大，能够满足同时生产大批量样品的同时，对生产的样品进行快速大量初筛的要求。即使非整合李斯特菌菌株间存在明显的表达差异，本公开的方法仍然可实现对非整合李斯特菌的快速大量筛选，进而获得表达效果最优的李斯特菌菌株，为非整合李斯特菌 疫苗 制备提供便利。，下面是一种筛选高表达外源蛋白的非整合减毒李斯特菌菌株的方法专利的具体信息内容。
1.一种检测由非整合的减毒李斯特菌所表达的外源蛋白的量的方法，其包含如下步骤：
(1)将所述李斯特菌和蛋白沉淀剂进行混合，得到混合液；将所述混合液混匀后沉淀；
(2)收集所述沉淀中的外源蛋白沉淀；
(3)将所述外源蛋白沉淀通过蛋白上样缓冲液溶解，得到外源蛋白溶解液；
(4)将所述外源蛋白溶解液进行变性后，在点样膜上点样，风干；加入封闭液封闭；
(5)将带有检测标记的，能够和外源蛋白发生反应的物质和所述点样膜孵育；
(6)将孵育后的点样膜上滴加显影液，通过显影设备显影；
(7)通过显影结果检测得到由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非整合的减毒李斯特菌含有重组核酸分子，所述重组核酸分子编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽，选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列与编码如SEQ ID NO：1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:3所示的多肽。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；
可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组核酸分子还包含连接序列，所述连接序列连接编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列和编码所述异源性抗原的核苷酸序列；可选的，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述连接序列包含编码如SEQ ID NO:16所示的序列的核苷酸序列；可选的，所述连接序列包含如SEQ ID NO:16所示的序列的一个、二个、或三个以上的重复。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，和所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列相连接的，包含所述异源性抗原的连接序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，所述启动子序列选自编码Phly基因的序列；可选的，所述重组核酸分子还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因；优选的，所述代谢产物选自次级代谢产物。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中，所述蛋白沉淀剂选自TCA/丙酮溶液。
11.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中，在得到所述外源蛋白沉淀后，溶解所述外源蛋白沉淀前，先将所述外源蛋白沉淀中的杂质成分去除；可选的，所述杂质成分选自TCA和/或丙酮。
12.一种筛选非整合的减毒李斯特菌的方法，其特征在于，将通过权利要求1-11任一项所述的方法检测得到由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量进行比较，筛选外源蛋白表达量更高的非整合的减毒李斯特菌。
13.根据权利要求12所述的筛选非整合的减毒李斯特菌的方法筛选得到的非整合的减毒李斯特菌。
一种筛选高表达外源蛋白的非整合减毒李斯特菌菌株的方法
技术领域
[0001] 本公开主要涉及生物技术领域。具体来说，本公开提供一种菌株的筛选方法。更具体来说，本公开提供一种筛选高表达外源蛋白的非整合减毒李斯特菌菌株的方法。
背景技术
[0002] 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种重要的食源性病原菌，对老人、儿童、孕妇及免疫抑制人群可能引起严重的李斯特菌病[1]。李斯特菌做为一种革兰氏阳性的胞内寄生菌，可在上皮细胞及吞噬细胞内存活并繁殖。李斯特菌由于其独特的侵染过程因此能够同时诱导炎症反应和激活MHC I型和II型抗原呈递途径的组合，使得李斯特菌成为一个具有很大应用前景的疫苗载体[2-4]。
[0003] 目前，国际上利用减毒LM菌株为载体构建肿瘤疫苗的方式主要有两种：整合型李斯特菌和非整合型李斯特菌疫苗[5]。整合型李斯特菌疫苗通常使用重组质粒利用同源重组技术将外源基因定点整合至李斯特菌基因组，在应用上存在外源蛋白表达稳定，能明显激活机体特异性免疫应答等优点，但存在疫苗构建周期长、整合构建筛选流程繁杂等缺点，因此延长疫苗制备周期，不利于临床个性化治疗。而相比之下，非整合李斯特菌疫苗仅通过质粒电转化构建，其流程简单快捷，疫苗制备周期短，同样能够分泌表达外源蛋白并有效激活机体特异性免疫应答[6-8]。但我们发现由于质粒电转化至李斯特菌中数量随机，使用抗生素筛选后同一培养板中单菌落间存在明显表达差异，最终会导致不同批次疫苗治疗效果存在差异。因此寻找和建立一种能够快速大量筛选高表达外源基因的李斯特菌菌株的技术，会为非整合李斯特菌疫苗的应用奠定基础。
[0004] 蛋白质印迹(Western blotting)技术是目前进行蛋白质表达、分析研究中应用最多的一种实验技术，它是将传统的高分辨率的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳和灵敏度高、特异性强的免疫探测技术相结合，最有效地分析目的蛋白的表达，在分子生物学中发挥着重要作用。样品经过SDS-PAGE凝胶电泳后分离，凝胶中的蛋白质用电印迹方法被转移至化学惰性的高分子转移膜上，然后将目的蛋白特异性一级抗体(一抗)与转移膜上的目的蛋白进行免疫结合反应，再用标记过(如HRP)的二级抗体(二抗)与一抗结合，通过检测二抗标记物来完成对目的蛋白的定性和半定量分析，该方法具有灵敏度高、特异性强等优点[9-10]。斑点印迹(Dot blotting)是一种将样品直接点在膜上进行抗体免疫结合检测的方法。该方法省去了电泳分离的步骤，属于简化的Western blot、northern blot等可用于检测DNA、RNA及蛋白。此外该方法还可定量蛋白浓度，对于同位素标记的探针，可通过直接测量放射性计数，或间接的有放射自显影来定量，对于酶标记的探针，通过测光密度值来定量[11]。由于该方法无电泳分离步骤，所以无法检测样品中蛋白大小，但是由于其实验流程简单、快捷、可同时检测大量样品使得其适用于样品粗筛，并广泛应用于食品快速检测、抗体有效性筛选及评估等领域[12-13]。在蛋白表达检测上，Western blot技术实验流程繁杂、实验耗时长，在李斯特菌表达检测上，Western blot实验所需样品制备量大、制备操作复杂、单次制备样品数量少，不利于大批量样品的快速粗筛。
[0005] 由于现有方案中仍然存在以上问题，因此，需要提供一种快速筛选高表达外源蛋白的非整合减毒李斯特菌菌株的方法，进而解决制备李斯特菌菌株的过程中，产生的李斯特菌菌落间可能存在差异性表达的问题。
[0006] 现有技术文献
[0007] [1]Ramaswamy V,Cresence V J,Lekshmi M,et al.Listeria-review of epidemiology and pathogenesis[J].Journal of microbiology,immunology,and infection＝Wei mian yu gan ran za zhi,2007,40(1):4.
[0008] [2]Cossart,P.,J.Pizarro-Cerda,and M.Lecuit,Invasion of mammalian cells by Listeria monocytogenes:functional mimicry to subvert cellular functions.Trends Cell Biol,2003.13(1):p.23-31.
[0009] [3]Mengaud,J.,et al.,Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes:listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin.Infect Immun,1987.55(12):p.3225-7.
[0010] [4]Tilney,L.G.and D.A.Portnoy,Actin filaments and the growth,movement,and spread of the intracellular bacterial parasite,Listeria monocytogenes.J Cell Biol,1989.109(4Pt 1):p.1597-608.
[0011] [5]Singh R,Wallecha A.Cancer immunotherapy using recombinant Listeria monocytogenes:transition from bench to clinic.[J].Hum Vaccin,2011,7(5):497-505.
[0012] [6]Singh R,Paterson Y.as a vector for tumor-associated antigens for cancer immunotherapy[J].Expert Review of Vaccines,2006,5(4):541.
[0013] [7]Wood L M,Paterson Y.Attenuated Listeria monocytogenes:a powerful and versatile vector for the future of tumor immunotherapy[J].Front Cell Infect Microbiol,2014,4:51.
[0014] [8]李文桂,陈雅棠.重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗的研制现状[J].中国病原生物学杂志,2013(1):80-86.
[0015] [9]Burnette W N.Western blotting:Electrophoretic transfer of proteins from SDS-PAGE to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A[J].Analytical Biochemistry,1981,112(2):195.
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[0017] [11]Towbin H,Gordon J.Immunoblotting and dot immunobinding—Current status and outlook[J].Journal of Immunological Methods,1984,72(2):313.[0018] [12]Cardona-Castro N,Gotuzzo E,Rodriguez M,et al.Clinical application of a dot blot test for diagnosis of enteric fever due to Salmonella enterica serovar typhi in patients with typhoid fever from Colombia and Peru[J].Clinical&Diagnostic Laboratory Immunology,2000,7(2):312.
[0019] [13]Moeremans M,Daneels G,Dijck A V,et al.Sensitive visualization of antigen-antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold/silver staining[J].Journal of Immunological Methods,1984,74(2):353-60.发明内容
[0020] 发明要解决的问题
[0022] 用于解决问题的方案
[0023] 在一个技术方案中，本公开提供一种检测由非整合的减毒李斯特菌所表达的外源蛋白的量的方法，其包含如下步骤：
[0024] (1)将所述李斯特菌和蛋白沉淀剂进行混合，得到混合液；将所述混合液混匀后沉淀；
[0025] (2)收集所述沉淀中的外源蛋白沉淀；
[0026] (3)将所述外源蛋白沉淀通过蛋白上样缓冲液溶解，得到外源蛋白溶解液；
[0028] (5)将带有检测标记的，能够和外源蛋白发生反应的物质和所述点样膜孵育；
[0029] (6)将孵育后的点样膜上滴加显影液，通过显影设备显影；
[0030] (7)通过显影结果检测得到由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量。
[0031] 在一个技术方案中，本公开提供一种检测由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量的方法，其中，上述非整合的减毒李斯特菌含有重组核酸分子，所述重组核酸分子编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽，选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽。可选的，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:3所示的多肽。
[0032] 在一个技术方案中，本公开提供一种检测由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量的方法，其中，上述非整合的减毒李斯特菌含有重组核酸分子，重组核酸分子中编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列与编码如SEQ ID NO：1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性。可选的，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:3所示的多肽。
[0033] 在一个技术方案中，本公开提供一种检测由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量的方法，其中，上述非整合的减毒李斯特菌含有重组核酸分子，所述重组核酸分子编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
[0034] 在一个技术方案中，本公开提供一种检测由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量的方法，其中，上述非整合的减毒李斯特菌含有重组核酸分子，所述重组核酸分子还包含连接序列，所述连接序列连接编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列和编码所述异源性抗原的核苷酸序列；其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原。可选的，所述连接序列包含编码如SEQ ID NO:16所示的序列的核苷酸序列；可选的，所述连接序列包含如SEQ ID NO:16所示的序列的一个、二个、或三个以上的重复。可选的，和所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列相连接的，包含所述异源性抗原的连接序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。
[0035] 在一个技术方案中，本公开提供一种检测由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量的方法，其中，上述非整合的减毒李斯特菌含有重组核酸分子，重组核酸分子中的启动子序列选自编码Phly基因的序列；可选的，所述重组核酸分子还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因；优选的，所述代谢产物选自次级代谢产物。
[0036] 在一个技术方案中，本公开提供一种检测由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量的方法，其中，所述蛋白沉淀剂选自TCA/丙酮溶液。
[0037] 在一个技术方案中，本公开提供一种检测由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量的方法，其中，在得到所述外源蛋白沉淀后，溶解所述外源蛋白沉淀前，先将所述外源蛋白沉淀中的杂质成分去除；可选的，所述杂质成分选自TCA和/或丙酮。
[0038] 在另一个技术方案中，本公开提供一种筛选非整合的减毒李斯特菌的方法，其特征在于，将前述的检测方法检测得到由非整合的减毒李斯特菌表达的外源蛋白的量进行比较，筛选外源蛋白表达量更高的非整合的减毒李斯特菌。
[0039] 发明的效果
[0040] 本公开采用的质粒pAM401在李斯特菌的多次传代过程中十分稳定，经过10-20次传代未发现质粒丢失或突变的现象，可以安全用于疫苗的构建。抗原基因的表达转录选用了李斯特菌LLO自带的启动子Phly，该启动子稳定高效，可以很好的启动转录翻译构建的编码异源性抗原的基因。同时以LLO自身的信号肽序列，在疫苗侵染细胞逃逸出溶酶体后，将表达的蛋白分泌到细菌外胞浆内，诱导细胞免疫应答。可选的，在质粒中加入了蛋白检测标签，例如Flag或His标签，用于蛋白表达分泌的检测。
[0041] 可选的，本公开采用的载体构建的方法以及通过前述方法得到的载体，可以不受异源性抗原上酶切位点的影响，操作方便，插入效率高，插入准确。
[0042] 可选的，本公开采用的技术方案在抗原肽设计优化上，根据大肠杆菌密码子偏好性作为优化标准符合李斯特菌表达特点，采用该方法优化设计的抗原肽可以在李斯特菌中表达，并具有良好的稳定性。李斯特菌携带的异源性抗原能够高效的分泌至宿主细胞内，以充分激活特异性肿瘤免疫反应，从理论上获得更好的治疗效果。
[0043] 可选的，本公开采用的技术方案极大提高了非整合李斯特菌肿瘤疫苗抗原肽的表达，使其在抗肿瘤免疫应答上作用更为突出。
[0044] 本公开采用的快速筛选高表达外源基因的非整合转染李斯特菌菌株的方法。其和常规的蛋白表达检测上使用的Western blot技术相比，本公开采用的方法耗时短、操作简洁、样品检测量大，能够满足同时生产大批量样品的同时，对生产的样品进行快速大量初筛的要求。
[0046] 图1所示的是在制备非整合李斯特菌菌株时，上述不同菌株形成的单菌落所表达的蛋白的表达量存在差异。其中，M所示的是250KDa蛋白梯状标准参照物；泳道1-5分别所示的是Lm 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-E7peptide-LLO524-529-His)在平板上1-5号菌落上清蛋白沉淀浓缩样。
[0047] 图2所示的是采用本公开的方法检测LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-PstI-LLO524-529-His)不同单菌落间蛋白的表达差异。其中，序号1-8所示的是LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-PstI-LLO524-529-His)平板上1-8号菌落培养1ml上清蛋白沉淀浓缩样。
[0048] 图3所示的是采用本公开的方法检测LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-PstI-LLO524-529-His)不同单菌落间蛋白的表达差异。其中，序号1-8所示的是LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-OVA28-LLO524-529-His)平板上1-8号菌落培养1ml上清蛋白沉淀浓缩样。
[0049] 图4所示的是采用本公开的方法检测LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-NY-ESO-1-LLO524-529-His)不同单菌落间蛋白的表达差异。其中，序号1-8所示的是LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-NY-ESO-1-LLO524-529-His)平板上1-8号菌落培养1ml上清蛋白沉淀浓缩样。
[0050] 图5所示的是采用本公开的方法检测LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-OVA28-LLO524-529-His)中1-6号菌所表达的蛋白的表达情况。
[0051] 图6所示的是采用Western blot方法检测LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-OVA28-LLO524-529-His)中1号2号4号6号菌所表达的蛋白的表达情况。
[0052] 图7所示的是采用本公开的方法检测LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-(G4S)2-E7-LLO524-529-His)中1-8号菌所表达的蛋白的表达情况。
[0053] 图8所示的是采用本公开的方法检测LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-(G4S)2-E7-LLO524-529-His)中1号菌的子代菌株所表达的蛋白的表达情况。
[0054] 图9所示的是LLO全长和常规LLO信号肽对于外源蛋白表达的影响。
[0055] 图10所示的是不同大小的抗原肽及有无G4S序列对表达载体的影响。
[0056] 图11所示的是用EG7-OVA皮下接种小鼠产生肿瘤，再用肿瘤疫苗治疗，检测抗肿瘤效果(肿瘤曲线结果)。
[0057] 图12所示的是用EG7-OVA皮下接种小鼠产生肿瘤，再用肿瘤疫苗治疗，检测抗肿瘤效果(T检验分析结果)。
[0058] 图13所示的是通过ELISPOT检测Lm OVA疫苗对小鼠体内特异性免疫反应的激活情况。
[0059] 图14所示的是四聚体实验验证OVA28肿瘤疫苗在小鼠体内特异性免疫反应。
[0060] 图15所示的是检测OVA28肿瘤疫苗的有效剂量和对小鼠体内肿瘤特异性免疫应答激活情况(肿瘤大小生长曲线结果)。
[0061] 图16所示的是检测OVA28肿瘤疫苗的有效剂量和对小鼠体内肿瘤特异性免疫应答激活情况(ELISPOT实验结果)。
[0062] 图17所示的是OVA28肿瘤疫苗与整合OVA的李斯特菌疫苗进行药效对比(肿瘤大小生长曲线结果)。
[0063] 图18所示的是OVA28肿瘤疫苗与整合OVA的李斯特菌疫苗进行药效对比(7天后ELISPOT实验结果)。
[0064] 图19所示的是OVA28肿瘤疫苗与整合OVA的李斯特菌疫苗进行药效对比(12天后ELISPOT实验结果)。
[0065] 图20所示的是OVA28肿瘤疫苗为非整合型OVA李斯特菌疫苗的验证结果(涂布平板结果)。
[0066] 图21所示的是OVA28肿瘤疫苗为非整合型OVA李斯特菌疫苗的验证结果(琼脂糖凝胶电泳的鉴定结果)。
[0067] 图22所示的是OVA28肿瘤疫苗为非整合型OVA李斯特菌疫苗的验证结果(琼脂糖凝胶电泳的鉴定结果)。
具体实施方式
[0068] 定义
[0070] 如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
[0071] 在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
[0072] 虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
[0073] 当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
[0074] 本公开中的术语“TCA/丙酮溶液”指的是TCA和丙酮的混合液。
[0075] 本公开中的术语“NY-ESO-1抗原”，是指纽约食管鳞状上皮癌抗原1。
[0076] 本公开中的术语“E7多肽”，是指来源于人乳头瘤病毒(HPV)的E7多肽。
[0077] 本公开中的术语“OVA”是指鸡卵白蛋白(Ovalbumin)，也称鸡卵清白蛋白，由386个氨基酸组成，其分子量约45kD。
[0078] 本公开中的术语“Phly”是编码LLO(溶菌素，Listeriolysion O)基因的启动子。
[0080] 本公开中的术语“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸”包括“保守突变”。本公开中的术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性例子为保守置换。保守置换是指，例如，在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr间相互置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val间相互置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn间相互置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His间相互置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu间相互置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr间相互置换的突变。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
[0081] 本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
[0082] 技术方案
[0084] SEQ ID NO:1所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO529)[0085] SEQ ID NO:2所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO529)[0086] SEQ ID NO:3所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO540)[0087] SEQ ID NO:4所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO540)[0088] SEQ ID NO:5所示的是LLO28的氨基酸序列
[0089] SEQ ID NO:6所示的是LLO28的核苷酸序列
[0090] SEQ ID NO:7所示的是OVA28的核苷酸序列
[0091] SEQ ID NO:8所示的是OVA28的氨基酸序列
[0092] SEQ ID NO:9所示的是OVA8的氨基酸序列
[0093] SEQ ID NO:10所示的是OVA8的核苷酸序列
[0094] SEQ ID NO:11所示的是5’端同源核苷酸序列
[0095] SEQ ID NO:12所示的是3’端同源核苷酸序列
[0096] SEQ ID NO:13所示的是连接序列的氨基酸序列
[0097] SEQ ID NO:14所示的是OVA8和连接序列相连的氨基酸序列
[0098] SEQ ID NO:15所示的是OVA28和连接序列相连的氨基酸序列
[0099] SEQ ID NO:16所示的是E7多肽的氨基酸序列
[0100] SEQ ID NO:17所示的是E7多肽的核苷酸序列
[0101] SEQ ID NO:18所示的是NY-ESO-1多肽的氨基酸序列
[0102] SEQ ID NO:19所示的是NY-ESO-1多肽的核苷酸序列
[0103] SEQ ID NO:20所示的是LLO22-267的氨基酸序列
[0104] SEQ ID NO:21所示的是LLO22-267的核苷酸序列
[0105] 实施例
[0106] 本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
[0107] 除非有明确的具体相反表述，否则本公开的所有实施例涉及的技术方案中，抗原肽的插入位点均位于相对于如SEQ ID NO:1所示的野生型LLO多肽的氨基酸序列的第523位和第524位氨基酸之间。
[0108] 除非有特别说明，否则本公开中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。
[0109] 本公开采用的主要试剂如下：
[0110] ECl化学发光超敏显色试剂盒(BIORAD)；TBST缓冲液(BIORAD)；脑-心浸出液肉汤BHI(广东环凯微生物科技有限公司)；质粒小量提取试剂盒PLASMID MINIPREP KIT 250-PREP(AXYGEN)；Q5PCR高保真酶(NEB)。
[0111] 对于实施例中采用的试剂，若无特别说明，均属于商业购买产品。
[0112] 实施例1：非整合减毒李斯特菌的固体和液体培养基、抗生素使用及非整合减毒李斯特菌的培养体系和菌株保存
[0113] 液体培养基BHI(脑心浸出液肉汤)：74g/L，自然pH值，121℃20min灭菌。
[0114] 固体培养基BHI：液体BHI的基础上，加入1.5g/L琼脂粉。121℃20min灭菌后，待温度降至50℃左右，加入抗生素(氯霉素抗性)，摇匀，倒板。
[0116] 培养体系：将约107CFU李斯特菌初始培养物(如LM-OVA28)加入5ml含氯霉素抗性的液体BHI培养基中，摇床230rpm、37℃摇床培养14-16h，即达到李斯特菌生长平台期，可用于后续实施例的实验。
[0117] 菌株保存：30-50％甘油(用水或培养基配制，灭菌后4℃储存)
[0118] 将含有菌株的培养液培养至平台期的菌体进行保存(李斯特菌初始加入量约107CFU 37℃、230rpm、摇床培养14-16h)。可选的，本公开采用如下两种菌株保存方式：①取
500μl菌液+500μl 50％甘油混匀；②取1.5ml菌液，9000rpm 1min离心得到菌体，去除培养基，用800μl 30-50％甘油重悬菌体。短期储存的温度为-30℃，如果需要长期储存，则储存温度为-80℃。
500μl菌液+500μl 50％甘油混匀；②取1.5ml菌液，9000rpm 1min离心得到菌体，去除培养基，用800μl 30-50％甘油重悬菌体。短期储存的温度为-30℃，如果需要长期储存，则储存温度为-80℃。
[0119] 实施例2：非整合减毒李斯特菌疫苗的制备及CFU浓度测定
[0120] 将含有约107CFU的李斯特菌初始培养物加入10ml含氯霉素抗性的液体BHI培养基中，摇床230rpm、37℃摇培14-16h，4500rpm 15-20min离心收集菌体，等体积的PBS洗涤菌体两次，用1/10体积的PBS(含7％DMSO)重悬菌体，分装，-80℃保存。
[0121] CFU统计方法：用PBS或培养基按照10倍梯度稀释菌体，梯度稀释时只能从上一个梯度稀释到下一个梯度，并且通过震荡充分混匀。分别取10-5、10-6、10-7、10-8浓度各100ul涂布BHI平板，计数菌落数。如10-8浓度长出菌落数为N，则CFU＝N x 10x 108个/ml。最终通过10-6、10-7、10-8算出菌落数进行平均即为样品CFU。
[0122] 实施例3：利用本公开的方法检测非整合减毒李斯特菌上清中分泌的外源蛋白表达量
[0123] 挑取培养李斯特菌的平板中的单菌落，加入至10ml含氯霉素抗性的液体BHI培养基中，摇床230rpm、37℃摇培14-16h，4500rpm 15-20min离心沉淀菌体。取上清1ml以3倍体积的10％TCA/丙酮溶液混匀，沉淀-20℃过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用30μl含0.01N NaOH的蛋白上样缓冲液溶解沉淀。煮沸变性后将30μl样品点在NC膜上，风干后TBST洗涤3次，每次5min。5％脱脂牛奶TBST封闭1h，TBST洗涤3次，每次5min。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育
1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次，每次5min。在NC膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次，每次5min。在NC膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
[0124] 实施例4：利用Western blot检测非整合减毒李斯特菌的外源蛋白表达
[0125] 挑取平板单菌落加入至10ml含氯霉素抗性的液体BHI培养基中，摇床230rpm、37℃摇培14-16h，4500rpm 15-20min离心沉淀菌体。取上清10ml以3倍体积的10％TCA/丙酮溶液混匀，沉淀-20℃过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用200μl含0.01N NaOH的蛋白上样缓冲液溶解沉淀，煮沸变性后-80℃保存。
[0126] 分别配置10％的分离胶和4％的浓缩胶，每孔上样20μl，80v电泳样品跑至浓缩胶分离胶交接处改为120v。待电泳完成后，取分离胶，将滤纸和0.22μm PVDF膜(预先甲醇中激活)剪成与胶同样大小，进行转膜冰浴200mA 1.5h。5％脱脂牛奶TBST封闭1h，TBST洗涤3次，每次5min。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次，每次5min。在PVDF膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
[0127] 实施例5：减毒李斯特菌的质粒的构建
[0128] 本公开中采用减毒的李斯特菌作为制备疫苗的载体菌株。示例性的，本公开用做疫苗的菌株采用的是Lm 10403SΔactA(前述菌株的构建方法可以示例性的参考下述文献：Shen H et.al.，PNAS，92(9):3987-91，1995)，该菌缺失actA基因，使得侵染宿主细胞的菌体不能通过其特有的肌动蛋白尾向临近细胞传播扩散，从而大大减弱其毒性及致病性。相比野生型菌株Lm10403S(LD50为1x 104)，Lm-ΔactA的LD50为0.5-1x108，被证明是高度减毒的。同时该菌保留了完整的LLO逃逸出溶酶体的能力，进入宿主细胞胞浆中快速增殖，并表达蛋白激活特异的T细胞免疫应答。
[0129] 本公开用做表达抗原基因的质粒基本构成如下：
[0130] (1)维持质粒复制稳定的基本序列：示例性的，本公开采用了pAM401作为质粒的基本序列；
[0132] (3)表达分泌抗原蛋白到李斯特菌外的信号肽序列：示例性的，本公开采用了LLO信号肽序列，例如LLO1-28所示的序列，及LLO22-529，用于增加外源蛋白的表达量；
[0133] (4)李斯特菌属于原核细胞，而通常需要用作肿瘤疫苗的抗原肽属于真核细胞，需要进行相应密码子优化方能在原核细胞中表达真核细胞蛋白。
[0134] (5)检测分泌蛋白的标签序列：示例性的，本公开采用了His tag作为标签序列；
[0135] (6)用于抗原肽插入的酶切位点：示例性的，本公开采用了PstI作为酶切位点。
[0136] 示例性的，本公开构建质粒pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-523-PstI-LLO524-529-His的方法如下：在质粒pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI基础上，以BamHI为酶切位点，将基因合成的BamHI-LLO22-529-His-BamHI序列通过酶切酶连反应构建在该载体上，得到pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-529-His-BamHI，为添加外源基因插入位点，选择在LLO523-524位置设计上下游引物，通过PCR反应，在LLO523和LLO524之间插入PstI酶切位点。
[0137] 使用基于一定同源序列的同源重组技术将产物克隆到pAM401-phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-523-PstI-LLO524-540-His载体(简称PstI载体质粒)上的PstI位点，其同源序列为：5’端同源序列(CCGAAATATAGTAATAAACTGCAG，SEQ ID NO:11)；3’端同源序列(CTGCAGGTAGATAATCCAATCGAA，SEQ ID NO:12)
[0138] 主要步骤如下：
[0139] PstI载体质粒20μl PstI单酶切体系：
[0140]PstI质粒 2μg
PstI限制性内切酶 2μl
10x NEB缓冲液3.1 2μl
去离子水 补齐至20μl
PstI限制性内切酶 2μl
10x NEB缓冲液3.1 2μl
去离子水 补齐至20μl
[0141] 37℃水浴锅，反应10min。
[0142] 将酶切产物进行DNA回收纯化，即酶切线性化PstI载体
[0143] 由以下(1)-(5)组份，得到同源重组20μl体系：
[0144] (1)酶切线性化的PstI载体
[0145] (2)外源PCR片段，两端含同源序列
[0146] (3)5x缓冲液：4μl
[0147] (4)反应酶：2μl
[0148] (5)ddH2O：补齐至20μl
[0149] 37℃水浴30分钟后转化E.coli感受态，涂布抗性平板，筛选单克隆进行测序验证。
[0150] 实施例6：减毒的李斯特菌疫苗的制备
[0151] 将测序验证正确的用于疫苗的减毒李斯特菌的质粒通过电转化技术，转化到减毒李斯特菌株中，挑选单克隆进行后续质粒及表达验证。
[0152] 上述电转化的具体步骤如下：
[0153] (1)电转化感受态的制备
[0154] (i)过夜培养的李斯特菌以1:50-1:200的比例转接到100-250ml的脑-心浸出液肉汤培养基(BHI)中，37℃振荡培养至OD600值0.2-0.25；
[0155] (ii)加入盘尼西林(PNG)至终浓度10μg/ml，继续培养约两个小时；
[0156] (iii)4℃高速离心5-10分钟收集菌体；
[0157] (iv)用200ml 10％甘油重悬菌体，洗涤两次；
[0158] (v)用45ml 10％甘油重悬菌体，并加入无菌的溶菌酶溶液，终浓度10μg/ml，常温20分钟，每隔10分钟颠倒混匀一次；
[0159] (vi)在4℃环境下，高速离心10分钟收集菌体，再用20ml 10％甘油洗涤菌体一次；
[0160] (vii)用1ml 10％甘油重悬菌体，50μl/管分装，-80℃保存。
[0161] (2)确定最适电转化条件：
[0162] (i)取一管感受态细胞，化冻，置于冰上；
[0163] (ii)将1μg待转的质粒加入感受态细胞中，混匀。
[0165] (iv)用BHI培养基重悬，常温静置1小时；
[0166] (v)将菌体涂布BHI+抗性平板，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落验证。
[0167] 验证通过的菌株/菌落可以作为减毒的李斯特菌疫苗。
[0168] 实施例7：非整合减毒李斯特菌不同单菌落间存在表达差异
[0169] 以Lm 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-E7peptide-LLO524-529-His)为例，通过Western blot实验，检测不同单菌落上清中分泌蛋白表达情况。具体实验步骤如下：分别挑取Lm 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-E7peptide-LLO524-529-His)上单菌落加入至10ml含氯霉素抗性BHI培养液中并依次标记为1-5号，37℃、230rpm摇床培养14-16h，随后4500rpm 15-20min离心沉淀菌体。取上清10ml以3倍体积的10％TCA/丙酮溶液混匀，沉淀-20℃过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用200μl含0.01N NaOH的蛋白上样缓冲液溶解沉淀，煮沸变性后-80℃保存。
[0170] 分别配置10％的分离胶和4％的浓缩胶，每孔上样20μl，80v电泳样品跑至浓缩胶分离胶交接处改为120V。待电泳完成后，取分离胶，将滤纸和0.22μm PVDF膜(预先甲醇中激活)剪成与胶同样大小，进行转膜冰浴200mA 1.5h。5％脱脂牛奶TBST封闭1h，TBST洗涤3次，每次5min。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次，每次5min。在PVDF膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
[0171] 实验结果如图1所示。实验结果表明，Lm 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-E7peptide-LLO524-529-His)平板上1-5号单菌落存在表达差异，其中3号和5号菌表达量较高，1号菌次之，2号和4号菌表达量较低。也就是说，实验结果证明不同单菌落间存在明显表达差异，因此需要建立一种快速大量筛选方法，帮助快速获得高表达菌株。
[0172] 实施例8：快速大量检测非整合减毒李斯特菌菌株分泌蛋白的表达的方法的建立[0173] 以不含抗原肽的菌株载体LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-PstI-LLO524-529-His)为例，提供一种用于快速大量检测李斯特菌分泌蛋白表达的方法。具体实验过程如下：分别挑取LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-PstI-LLO524-529-His)平板上单菌落加入至10ml含氯霉素抗性BHI培养液中并依次标记为1-8号，摇床230rpm、37℃摇培14-16h，4500rpm 15-20min离心沉淀菌体。取上清1ml以3倍体积的10％TCA/丙酮溶液混匀，沉淀-20℃过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用30μl含0.01N NaOH的蛋白上样缓冲液溶解沉淀。煮沸变性后将30μl样品点在NC膜上，风干后TBST洗涤3次，每次5min。5％脱脂牛奶TBST封闭1h，TBST洗涤3次，每次5min。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次，每次5min。在NC膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
[0174] 实验结果如图2所示。实验结果表明，LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-PstI-LLO524-529-His)平板上不同单菌落存在表达差异，1-5号表达较强，6-8号表达较弱。因此基于本实施例的方法可迅速检测出不同单菌落表达情况，并挑取其中表达较高的菌落进行疫苗制备。
[0175] 实施例9：快速筛选不同非整合减毒李斯特菌菌株的OVA28抗原肽的表达量的方法[0176] 以LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-OVA28-LLO524-529-His)为例，验证分泌表达OVA28抗原肽的非整合减毒李斯特菌是否存在表达差异。具体实验过程：分别挑取LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-OVA28-LLO524-529-His)平板上单菌落加入至10ml含氯霉素抗性BHI培养液中并依次标记为1-8号，摇床230rpm、37℃摇培14-16h，4500rpm 15-20min离心沉淀菌体。取上清1ml以3倍体积的10％TCA/丙酮溶液混匀，沉淀-20℃过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用30μl含0.01N NaOH的蛋白上样缓冲液溶解沉淀。煮沸变性后将30μl样品点在NC膜上，风干后TBST洗涤3次，每次5min。5％脱脂牛奶TBST封闭1h，TBST洗涤3次，每次5min。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次，每次5min。在NC膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
[0177] 实验结果如图3所示。实验结果表明，LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-OVA28-LLO524-529-His)平板上不同单菌落存在表达差异，1号2号5号表达较高，其余表达较弱。因此基于本方法可迅速检测出不同单菌落分泌表达OVA28抗原肽情况，并挑取其中表达较高的菌落进行疫苗制备，可保证该疫苗的有效性。
[0178] 实施例10：快速筛选不同非整合减毒李斯特菌菌株的NY-ESO-1抗原肽的表达量的方法
[0179] 以LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-NY-ESO-1-LLO524-529-His)为例，验证分泌表达NY-ESO-1抗原肽的非整合李斯特菌是否存在表达差异。具体实验过程如下：分别挑取LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-NY-ESO-1-LLO524-529-His)平板上单菌落加入至10ml含氯霉素抗性BHI培养液中并依次标记为1-8号，摇床230rpm、37℃摇培14-16h，4500rpm 15-20min离心沉淀菌体。取上清1ml以3倍体积的10％TCA/丙酮溶液混匀，沉淀-20℃过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留TCA。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用30μl含0.01N NaOH的蛋白上样缓冲液溶解沉淀。煮沸变性后将30μl样品点在NC膜上，风干后TBST洗涤3次，每次5min。5％脱脂牛奶TBST封闭1h，TBST洗涤3次，每次5min。使用HRP标记的Anti-His抗体室温孵育1.5h或4℃过夜，TBST洗涤3次，每次5min。在NC膜上滴加ECL显影液，Bio-Rad凝胶成像仪进行显影。
[0180] 实验结果如图4所示。实验结果表明，LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-NY-ESO-1-LLO524-529-His)平板上不同单菌落存在表达差异，6号表达较高，其余表达较弱。因此基于本方法可迅速检测出不同单菌落分泌表达NY-ESO-1抗原肽的表达量情况，并挑取其中表达较高的菌落进行疫苗制备，可保证该疫苗的有效性。
[0181] 实施例11：验证从不同非整合减毒李斯特菌菌株中快速大量筛选抗原肽表达量较高的菌株的准确性
[0182] 先利用本公开实施例3或实施例9中的方法，对非整合减毒李斯特菌菌株进行快速大量初步筛选，再从筛选得到的表达量较高的菌株中随机挑取几株菌落，通过Western blot方法检测其表达量，以验证筛选方法的准确性。
[0183] 以LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-OVA28-LLO524-529-His)为例，我们首先在LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-523-(G4S)2-OVA28-LLO524-529-His)平板上挑取单菌落加入至10ml含氯霉素抗性BHI培养液中并依次标记为1-6号，按照本公开实施例3或实施例9记载的方法进行筛选。随机筛选得到的表达量较高的菌株，通过Western blot实验进行验证。
[0184] 快速大量初步筛选的实验结果如图5所示。实验结果表明，1-6号菌落存在明显表达差异。因此我们随机选取1号2号4号6号菌株进行Western blot实验(实验步骤如实施例5)。Western blot的实验结果如图6所示。实验结果表明，图6中的4号6号菌表达较高，而1号
2号表达较低，与图5所示的实验结果相符。因此采用本公开记载的方法可实现非整合李斯特菌种快速大量筛选高表达的菌株，且具有准确性，可用作非整合李斯特菌疫苗制备前的一个指标。
2号表达较低，与图5所示的实验结果相符。因此采用本公开记载的方法可实现非整合李斯特菌种快速大量筛选高表达的菌株，且具有准确性，可用作非整合李斯特菌疫苗制备前的一个指标。
[0185] 实施例12：通过本公开的方法筛选亲本非整合减毒李斯特菌菌株后，得到的子代菌株的抗原肽表达量的确定
[0186] 以LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-(G4S)2-E7-LLO524-529-His)为例，首先在LM 10403SΔactA(pAM401-LLO1-28-LLO22-267-(G4S)2-E7-LLO524-529-His)平板上挑取单菌落加入至10ml含氯霉素抗性BHI培养液中并依次标记为1-8号，按照本公开实施例3或实施例9记载的方法进行筛选。在得到的非整合减毒李斯特菌菌株菌子代单菌落中挑取并按照本公开实施例3或实施例9记载的方法进行实验。
[0187] 对亲本进行筛选得到的实验结果如图7所示。实验结果表明，1-8号菌落的抗原肽表达量存在明显表达差异，其中1号菌的抗原肽表达量明显最高。因此取1号菌在含氯霉素抗性平板上进行划线培养，并且在1号菌子代单菌落中挑取并按照本公开实施例3或实施例9记载的方法，对抗原肽的表达量进行确认。实验结果如图8所示。实验结果表明，1号菌子代菌株大部分均具有较高表达水平，其中子代菌3号表达明显高于母代1号菌。因此，本公开的方法可反复多次筛选非整合减毒李斯特菌菌株，最终从前述菌株的子代中获得表达较高的菌株。
[0188] 实施例13：LLO全长和常规LLO信号肽对于外源蛋白表达的影响
[0189] 在实施例5得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例13所采用的相应质粒。为进一步提高外源蛋白表达量，通过对比使用LLO28信号肽区段(pAM401-Phly-LLO28-His)或含信号肽的全LLO540区段(pAM401-Phly-LLO540-His)对于其后外源蛋白表达的影响，检测LLO全长是否比常规LLO信号肽更利于外源蛋白表达。
[0190] 将构建的pAM401-Phly-LLO28-His或pAM401-Phly-LLO540-His载体质粒电转化至减毒Lm菌株，将菌株按照1:100接种至含氯霉素抗性的10mlBHI(脑心浸液肉汤)液体培养基，于37℃恒温摇床230rpm摇培12-14h。随后将菌液高速离心10min，取上清后加入TCA(三氯乙酸)/丙酮溶液，混匀后-20℃沉淀。随后超高速离心收集蛋白沉淀，沉淀用丙酮洗涤两次。最后使用含0.01N NaOH的蛋白Loading Buffer重悬沉淀，98℃金属浴变性5min，-80℃冰箱保存。蛋白检测使用western blot实验检测，使用Anti-His-HRP抗体检测。
[0191] 实验结果如图9所示。结果显示LLO540实验组表达量明显高于LLO28实验组，因此此后实验采用LLO540全长序列带动外源蛋白表达，可获得理想的表达效果。
[0192] 实施例14：不同大小的抗原肽及有无G4S序列对表达载体的影响
[0193] 在实施例5得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例14所采用的相应质粒。将分别构建的含有pAM401-Phly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His、pAM401-Phly-LLO540-(G4S)2-OVA8-(G4S)2-His、pAM401-Phly-LLO540-OVA28-His质粒的减毒Lm菌株按照1:100接种至含氯霉素抗性的10ml BHI(脑心浸液肉汤)液体培养基，并以含pAM401-Phly-LLO540-His载体的减毒Lm菌株为对照，于37℃恒温摇床230rpm摇培12-14h。随后将菌液高速离心10min，取上清后加入TCA(三氯乙酸)/丙酮溶液，混匀后-20℃沉淀。随后超高速离心收集蛋白沉淀，沉淀用丙酮洗涤两次。最后使用含0.01N NaOH的蛋白Loading Buffer重悬沉淀，98℃金属浴变性5min，-80℃冰箱保存。蛋白检测使用western blot实验检测，使用Anti-His-HRP抗体检测。
[0194] 实验结果如图10所示。结果显示含有(G4S)2-OVA28-(G4S)2、(G4S)2-OVA8-(G4S)2、OVA28序列的减毒Lm菌株均具有较高的表达量，其中含(G4S)2序列未对抗原肽表达产生影响，并且具有相对更高的蛋白表达水平；与此同时，不同大小的OVA抗原肽对表达影响也不大，均具有较高水平的表达量。表明本实验体系可适用于外源抗原肽的分泌表达。在本公开的一个技术方案中，可以使用(G4S)2做为连接肽。
[0195] 实施例15：用EG7-OVA皮下接种小鼠产生肿瘤，再用肿瘤疫苗治疗，检测抗肿瘤效果
[0196] 在实施例5得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例15所采用的相应质粒。对小鼠进行EG7-OVA肿瘤皮下接种，接种后第6天开始进行肿瘤测量，实验分成三组(pAM401对照组、pAM401-LLO540对照组、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组)，第9天进行pAM401、pAM401-LLO540、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2三组肿瘤疫苗的尾静脉注射，注射剂量为107cfu(LmΔactA减毒李斯特菌小鼠半致死量LD50：108，因此选用0.1倍半致死量做为最高注射剂量)并持续跟踪测量。肿瘤大小跟踪测量24天，得到肿瘤曲线。与此同时，通过图基多重比较检验，分析第20、22、24天三组数据。
[0197] 肿瘤曲线结果如图11所示。可见OVA28治疗组相比pAM401、pAM401-LLO540两组在疫苗注射后肿瘤大小明显出现消除趋势。T检验分析结果如图12所示，显示实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28与对照组pAM401、pAM401-LLO540相比均呈显著性差异，而pAM401-LLO540组与pAM401组无显著性差异。
[0198] 综合上述实验结果，可以通过李斯特菌携带抗原肽OVA28激活机体免疫系统，进而实现对EG7-OVA肿瘤的特异性抗肿瘤反应，而单独表达的LLO540并未参与抗原肽抗肿瘤免疫反应。
[0199] 实施例16：通过ELISPOT检测Lm OVA疫苗对小鼠体内特异性免疫反应的激活情况[0200] 在实施例5得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例16所采用的相应质粒。实验分组为：pAM401对照组、pAM401-LLO540对照组、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组以及阳性对照组OT1。OT1转基因小鼠其具有编码OVA特异性T细胞抗原受体的完整基因，因此选来做阳性对照，实验首先进行pAM401、pAM401-LLO540、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2三组肿瘤疫苗的尾静脉注射，疫苗注射第6天通过颌下取血分离外周血单个核细胞进行ELISPOT相关实验，取血过程通过加入EDTA作为抗凝剂，随后通过红细胞裂解液裂解红细胞，PBS洗两次400xg离心5min获得外周血单个核细胞，最终分别使用100μl的1640完全培养基(含10％FBS及1％双抗)重悬细胞加入ELISPOT预处理孔板中。随后通过在ELISPOT孔板中加入OVA多肽刺激外周血单个核细胞产生IFN-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应OVA多肽的特异性免疫反应情况(具体ELISPOT实验流程参照BDTMELISPOT Mouse IFN-γELISPOTSet说明书，产品货号551083)。
[0201] 实验结果如图13所示。结果显示OT1阳性对照组出斑明显，表明实验操作没有问题，pAM401以及pAM401-LLO540对照组出斑数均在10以内，表明未出现明显特异性免疫反应，而相比之下pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组出斑数均在200以上有明显ELISPOT反应，表明注射的LM-OVA28肿瘤疫苗可激活小鼠免疫系统的肿瘤特异性免疫应答，证明疫苗的功能性。
[0202] 实施例17：四聚体实验验证OVA28肿瘤疫苗在小鼠体内特异性免疫反应
[0203] 在实施例5得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例17所采用的相应质粒。实验分组为：pAM401对照组、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组以及OT1阳性对照组。将pAM401和pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2两组分别进行疫苗注射后第7天，颌下取血，进行OVA四聚体染色及流式抗体CD8-PB和CD3-PE染色，通过流式细胞仪进行检测。
[0204] 实验结果如图14所示。通过流式检测发现：OT1阳性对照组OVA特异性识别的CD8+T细胞比例为95.34％，符合OT1特性表明实验操作无误，pAM401对照组OVA特异性识别的CD8+T细胞比例为0.45％，pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组OVA特异性识别的CD8+T细胞比例为25.96％明显高于对照组。表明通过注射高表达OVA28的Lm疫苗可激活C57小鼠体内特异性免疫反应，且有效提高OVA特异性识别的CD8+T细胞比例，增强OVA特异性肿瘤免疫反应。
[0205] 实施例18：检测OVA28肿瘤疫苗的有效剂量和对小鼠体内肿瘤特异性免疫应答激活情况
[0206] 在实施例5得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例18所采用的相应质粒。使用EG7-OVA细胞皮下接种20只C57小鼠进行肿瘤模型建立。通过将OVA28肿瘤疫苗以107为标准设立多个梯度剂量进行实验。实验共分四组：pAM401-LLO540(107)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(107)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(106)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(105)。EG7-OVA肿瘤模型建立后第6天开始进行肿瘤测量，第7天进行疫苗尾静脉注射，并持续跟踪测量肿瘤大小生长曲线。
[0207] 在疫苗注射后第7天通过颌下取血，并通过红细胞裂解液裂解红细胞最终获得外周血单个核细胞进行ELISPOT实验。ELISPOT分组：以OT1小鼠为阳性对照，pAM401-LLO540组为实验对照组，实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(107)、pAM401-LLO540-(G4S)2-6 5
OVA28-(G4S)2(10)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(10)各随机选取三只小鼠取血，每只小鼠取出的外周血单个核细胞均分成两份，一份使用OVA多肽刺激，一份未加入OVA多肽刺激。
OVA28-(G4S)2(10)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(10)各随机选取三只小鼠取血，每只小鼠取出的外周血单个核细胞均分成两份，一份使用OVA多肽刺激，一份未加入OVA多肽刺激。
[0208] 肿瘤大小生长曲线结果如图15所示。结果显示实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-7 6
OVA28-(G4S)2(10)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(10)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(105)在第12天均开始出现肿瘤大小下降趋势，在第15天均出现肿瘤明显消除现象。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量107cfu、106cfu、105cfu均具有明显消瘤功效。
OVA28-(G4S)2(10)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(10)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(105)在第12天均开始出现肿瘤大小下降趋势，在第15天均出现肿瘤明显消除现象。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量107cfu、106cfu、105cfu均具有明显消瘤功效。
[0209] ELISPOT实验结果如图16所示。结果显示各组中未加入OVA多肽对照组均无ELISPOT反应，阳性对照组OT1加入OVA多肽刺激出现明显ELISPOT反应，pAM401-LLO540对照组加入多肽刺激未出现ELISPOT反应表明单独表达LLO不能激活机体OVA特异性免疫应答，而实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(107)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(106)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2(105)加入OVA刺激后均出现强烈的ELISPOT反应。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量107cfu、106cfu、105cfu均能够激活小鼠体内OVA特异性肿瘤免疫反应。
[0210] 实施例19：OVA28肿瘤疫苗与整合OVA的李斯特菌疫苗进行药效对比
[0211] 在实施例5得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例19所采用的相应质粒。使用EG7-OVA细胞皮下接种20只C57小鼠进行肿瘤模型建立。实验共分四组：LMΔactA(pAM401)对照组(非整合型)、LMΔactA(pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2)实验组(非整合型)；LMΔactA对照组(整合型)、LM-OVA ΔactA实验组(整合型)。EG7-OVA肿瘤模型建立后第6天开始进行肿瘤测量，第7天进行疫苗尾静脉注射(注射剂量105cfu)，并持续跟踪测量，测定肿瘤生长曲线。
[0212] 同样的采用ELISPOT进行功能学验证，在疫苗注射后第7天通过颌下取血，并通过红细胞裂解液裂解红细胞最终获得外周血单个核细胞进行ELISPOT实验。通过在ELISPOT孔板中加入OVA多肽刺激外周血单个核细胞产生IFN-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应OVA多肽的特异性免疫反应情况。接下来在12天分别摘眼球取血和取脾脏组织进行ELISPOT实验，外周血单个核细胞和之前实验一样接种细胞量为1～10x105，脾脏组织研磨后过75μm过滤器离心收集实验接种量为1x105以及1x106。
[0213] 肿瘤生长曲线实验结果如图17所示。LMΔactA(pAM401)对照组及LMΔactA对照组肿瘤大小均处于持续增长状态。LMΔactA(pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2)实验组在第11天肿瘤大小开始下降，在第17天肿瘤明显消除。LM-OVAΔactA实验组在疫苗注射后直到第19天肿瘤大小均得到控制，无明显生长也无明显消除。实验结果表明本实验方法下构建的OVA28非整合肿瘤疫苗较整合型OVA李斯特菌疫苗具有更好的消瘤功效。
[0214] 7天后ELISPOT实验结果如图18所示。对照组LMΔactA(pAM401)、LMΔactA及实验组LM-OVAΔactA均无明显ELISPOT反应，而LMΔactA(pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2)实验组有明显强烈ELISPOT反应。表明本实验方法下构建的OVA28非整合肿瘤疫苗较整合型OVA李斯特菌疫苗能更好的激活体内肿瘤特异性免疫反应。
[0215] 12天后ELISPOT实验结果如图19所示。与7天ELISPOT结果一致，实验组LM-OVAΔactA无明显ELISPOT反应，而LMΔactA(pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2)实验组在外周血单个核细胞及脾脏中均有明显强烈ELISPOT反应。
[0216] 实施例20：OVA28肿瘤疫苗为非整合型OVA李斯特菌疫苗
[0217] 取本公开前述实施例中得到的LM菌株，例如在一个技术方案中，取LM10403SΔactA(pAM401-Phly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株，摇菌过夜后，提取质粒并电转化至新的LM感受态中涂布CM抗性平板，并以未电转化的LM感受态菌株涂板为阴性对照。电转化的方法参见本公开实施例6中的相关方案。
[0218] 通过质粒电转化LM感受态方法，只有电转化质粒的LM才能在CM抗性下存活。前述涂布平板的结果如图20所示。
[0219] 对于涂布平板后得到的LM菌落，通过本领域的常规生物学方法，提取上述菌落中的菌株的全DNA，并以LM 10403SΔactA菌株为阴性对照，以质粒pAM401-Phly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His为阳性对照，通过1％琼脂糖凝胶电泳，随后通过对凝胶上LM的基因组DNA和质粒DNA进行切胶回收，从而获得纯化的LM基因组DNA和质粒DNA。再分别以上述得到的纯化DNA为模板对OVA28序列通过PCR反应扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
[0220] 琼脂糖凝胶电泳的鉴定结果如图21-22所示。通过分子实验证明，以LM10403SΔactA(pAM401-Phly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株基因组DNA为模板PCR无目的基因序列，而以LM 10403SΔactA(pAM401-Phly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株质粒DNA为模板PCR有大小正确的目的基因条带(目的条带大小为200bp，50bp处为引物二聚体)。上述实验结果表明目的基因只存在于质粒上而不会整合至基因组DNA中。因此证明利用本公开的方法构建得到的LM疫苗为非整合型LM疫苗。
[0221] 本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
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