具反式萘烷环的聚酮化合物及其制备方法和应用
阅读：22发布：2020-05-11
专利汇可以提供具反式萘烷环的聚酮化合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 微 生物 农药 技术领域，具体是一种从菌株Penicillium sp.TR85(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2019年8月2日，保藏号：CGMCC No.18116)固体 发酵 产物中得到具反式 萘 烷环的聚 酮 化合物及其分离纯化方法和在除草方面的应用。具反式萘烷环的聚酮化合物为式(一)所示化合物1和化合物2以及两者在农药上可接受的盐或 溶剂 合物。在10μg/mL浓度时，化合物1和化合物2对稗草[Echinochloa crusgalli] 幼苗 胚根的生长抑制率分别为81.5％与79.6％，优于商品化 除草剂 乙草胺，可作为具有 除草活性 的先导化合物或新农药成分。，下面是具反式萘烷环的聚酮化合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.式(一)所示化合物1和化合物2以及两者在农药上可接受的盐或溶剂合物：
2.一株青霉菌，其特征在于，所述青霉菌为青霉(Penicillium sp.)TR85，于2019年8月
2日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18116，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。
3.根据权利要求1所述化合物，其特征在于，由权利要求2所述青霉菌发酵获得。
4.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，步骤为：将权利要求2所述青霉菌TR85接种至已灭菌的固体培养基中，室温静置发酵，发酵产物经提取纯化获得。
5.根据权利要求4所述化合物的制备方法，其特征在于，所述固体培养基为每100mL天然海水中加入大米100g，蛋白胨0.6g。
6.根据权利要求4所述化合物的制备方法，其特征在于，所述发酵产物的提取纯化步骤为：
(1)发酵产物经乙酸乙酯浸泡提取，合并提取液进行浓缩，获得发酵粗提物；
(2)将上述发酵粗提物进行减压硅胶柱层析，按照洗脱液极性递增顺序，以梯度为40:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯作为溶剂进行梯度洗脱；收集石油醚-乙酸乙酯＝1:1洗脱组分，进行反相硅胶柱层析，以梯度为2:8至1:0(v/v)的甲醇-水作为溶剂进行梯度洗脱；
(3)收集甲醇-水＝6:4(v/v)反相硅胶洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为50％甲醇-水，检测波长为220nm，流速为3mL/min，收集保留时间tR值为14.4min的组分，即得式(一)所示化合物1；
(4)收集甲醇-水＝8:2(v/v)反相硅胶洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为76％甲醇-水，检测波长为220nm，流速为3mL/min，收集保留时间tR值为12.5min的组分，即得式(一)所示化合物2。
7.具反式萘烷环的聚酮化合物在杂草防治中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述具反式萘烷环的聚酮化合物为权利要求
1所述化合物中的至少一种。
9.除草组合物，其特征在于，其有效成分包含具反式萘烷环的聚酮化合物中的至少一种。
10.根据权利要求9所述除草组合物，其特征在于，所述具反式萘烷环的聚酮化合物为权利要求1所述化合物中的至少一种。
具反式萘烷环的聚酮化合物及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 杂草与农作物争夺营养与生长空间，不仅引起农作物减产，也能够破坏田间生态平衡，因此杂草防治对农业生产意义重大。稗草[Echinochloa crusgalli]是世界性恶性杂草，在我国稻田的主要杂草中，稗草发生及危害面积最大，约占稻田总面积的43％。长期以来，化学合成除草剂虽然能够有效防治杂草，但是已经引起环境污染、杂草产生抗药性等问题；同时长期过量使用也造成农药残留超标，危及农产品安全及人类健康。从微生物、植物等生物资源中寻找除草活性成分，具有毒性低、环境兼容性好及不易产生抗药性等优点，已经成为开发“环境友好”除草剂的重要来源。
[0003] 根据文献调研，具反式萘烷环的聚酮化合物具有抑菌、抗肿瘤及免疫调节活性，未见其具有除草活性的相关报道。而本发明涉及的两个具反式萘烷环的聚酮化合物为新化合物，且首次发现具反式萘烷环的聚酮化合物具有除草潜力，其结构显著区别于已知商品化除草剂，为进一步开发新型生物源除草剂提供了指引。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种具反式萘烷环的聚酮化合物及其制备方法和在除草方面的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
[0006] 式(一)所示化合物1和化合物2以及两者在农药上可接受的盐或溶剂合物：
[0007]
[0008] 一株青霉菌，为青霉(Penicillium sp.)TR85，于2019年8月2日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18116，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。
[0009] 在上述方案的基础上，上述化合物由上述青霉菌发酵获得。
[0010] 上述化合物的制备方法，步骤为：将上述青霉菌TR85接种至已灭菌的固体培养基中，室温静置发酵，发酵产物经提取纯化获得。
[0012] 在上述方案的基础上，所述发酵产物的提取纯化步骤为：
[0013] (1)发酵产物经乙酸乙酯反复浸泡提取，合并提取液进行浓缩，获得发酵粗提物；
[0014] (2)将上述发酵粗提物进行减压硅胶柱层析，按照洗脱液极性递增顺序，以梯度为40:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯作为溶剂进行梯度洗脱；收集石油醚-乙酸乙酯＝1:1(v/v)洗脱组分，进行反相硅胶柱层析，以梯度为2:8至1:0(v/v)的甲醇-水作为溶剂进行梯度洗脱；
[0015] (3)收集甲醇-水＝6:4(v/v)反相硅胶洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为50％甲醇-水，检测波长为220nm，流速为3mL/min，收集保留时间tR值为14.4min的组分，即得式(一)所示化合物1；
[0016] (4)收集甲醇-水＝8:2(v/v)反相硅胶洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为76％甲醇-水，检测波长为220nm，流速为3mL/min，收集保留时间tR值为12.5min的组分，即得式(一)所示化合物2。
[0017] 具反式萘烷环的聚酮化合物在杂草防治中的应用。
[0018] 在上述方案的基础上，所述具反式萘烷环的聚酮化合物为上述化合物中的至少一种。
[0019] 除草组合物，其有效成分包含具反式萘烷环的聚酮化合物中的至少一种。
[0020] 在上述方案的基础上，所述除草组合物中所述具反式萘烷环的聚酮化合物为上述化合物中的至少一种。
[0021] 在上述方案的基础上，所述杂草为稗草。
[0022] 本发明的化合物可以与其他药物组成组合物形式；该组合物包含式(一)所示化合物及农药上可接受的盐和/或溶剂合物作为活性成分，以及农药上可接受的载体，本发明化合物可以与其他活性成分组合使用，只要它们之间不产生拮抗作用。
[0023] 本发明的除草剂还可以包含农药上可接受的常规助剂，可以为载体、表面活性剂和安全剂；根据其助剂组成可以制备成任何需要的制剂形式，例如乳油、悬浮剂、微乳剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂、悬乳剂、水乳剂或水分散粒剂。也可以含有农药中其他常规的组分，例如如稳定剂、螯合剂、染料、着色剂、保护胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、渗透剂和聚合物。
[0024] 除草剂中含有本发明组合物的量依赖杂草的抗性强弱、施药方式和施药频率；本领域普通技术人员仅仅利用常规实验方法即可确定适当的用量。
[0025] 本文所用术语“本发明化合物”表示以任何形式的式(一)化合物，即任何盐或非盐形式(例如，以游离酸或游离碱形式，或以其药学上可接受的盐形式)及其任何物理形式(例如，包括非固体形式(例如，液体或半固体形式)，和固体形式(例如，无定形或晶型，特定的多晶型形式，溶剂合物，包括水合物(例如，单-、二-和半-水合物))，及其多种形式的混合物。
[0026] 溶剂合物
[0027] 对于以晶体形式存在的本发明化合物或其盐的溶剂合物，本领域技术人员将理解可形成农药上可接受的溶剂合物，其中在结晶时溶剂分子被掺入晶格中。溶剂合物可包含非水溶剂例如乙醇、异丙醇、DMSO、乙酸、乙醇胺和乙酸乙酯，或者它们可包含水作为溶剂(该溶剂被掺入晶格中)。其中水为溶剂(该溶剂被掺入晶格中)的溶剂合物通常称为“水合物”。水合物包含化学计量的水合物以及包含可变量水的组分。本发明包括该类溶剂合物。
[0028] 本发明所具有的优点：
[0029] (1)本发明所涉及的具反式萘烷环的聚酮化合物1与化合物2为新化合物，并首次发现具反式萘烷环的聚酮化合物具有除草活性。在10μg/mL浓度时，化合物1与化合物2对稗草(Echinochloa crusgalli)幼苗胚根的生长抑制率分别为81.5％与79.6％，优于商品化除草剂乙草胺，可作为具有除草活性的先导化合物或新农药成分。
[0030] (2)本发明所涉及的具反式萘烷环的聚酮化合物1与化合物2由菌株Penicillium sp.TR85发酵产生，便于进行规模发酵生产；其次，化合物1与化合物2为天然产物，相比较化学合成农药，具有环境兼容性好、不易产生抗药性等优点。附图说明
[0031] 图1为化合物1的1H NMR谱图。
[0032] 图2为化合物1的13C NMR谱图。
[0033] 图3为化合物2的1H NMR谱图。
[0034] 图4为化合物2的13C NMR谱图。
[0035] 图5为化合物1对稗草幼苗生长的抑制作用。
[0036] 图6为化合物2对稗草幼苗生长的抑制作用。
具体实施方式
[0037] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0038] 下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0039] 本发明从菌株Penicillium sp.TR85(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年8月2日，保藏号：CGMCC No.18116)的发酵产物中分离得到如下的实施例中所指的化合物，其中，化合物1和化合物2的结构如下(结构中的阿拉伯数字为碳原子的标位)：
[0040]
[0041] 实施例1：菌株Penicillium sp.TR85的分离鉴定
[0042] (1)菌株分离
[0043] 本发明所述菌株TR85是从耐盐碱植物碱蓬的根中分离得到。
[0044] 样品采集：碱蓬样品采集自青岛市胶州湾潮间带湿地；
[0045] 分离步骤：将碱蓬样品的根冲洗干净，75％乙醇浸泡2min，无菌水漂洗3～4次，无菌纱布蘸干水份；将碱蓬样品的根剪成0.5cm小段，植入PDA双抗培养基平板中，每皿植入4～5片，置于培养箱中，28℃倒置培养，每隔24h观察一次；挑取切面处的菌丝，采用平板划线法接种至PDA双抗培养基平板中，经反复纯化，得到菌落形态特征一致的碱蓬来源菌株，并编号保存。
[0047] (2)菌株鉴定
[0048] 将菌株TR85接种至PDA平板表面，28℃培养5-7天后观察。菌丝初期为白色，后产生深绿色孢子，并能够产生棕黄色色素。
[0049] 所述菌株的rDNA基因序列测定结果(ITS-5.8S-ITS2区)如下：
[0050] tccgtaggtg aaccttgcgg ttggggtcca acctcccacc cgtgtttatt ttaccttgtt gcttcggcgg gcccgccttt actggccgcc ggggggctca cgcccccggg cccgcgcccg ccgaagacac cctcgaactc tgtctgaaga ttgaagtctg agtgaaaata taaattattt aaaactttca acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga tacgtaatgt gaattgcaaa ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcac attgcgcccc ctggtattcc ggggggcatg cctgtccgag cgtcattgct gccctcaagc ccggcttgtg tgttgggccc cgtcctccga ttccggggga cgggcccgaa aggcagcggc ggcaccgcgt ccggtcctcg agcgtatggg gctttgtcac ccgctctgta ggcccggccg gcgcttgccg atcaacccaa atttttatcc aggttgacct cggatcaggt agggataccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg a
[0051] 上述序列测定结果与Genbank数据库中已知菌株的相应序列信息比较，其与菌株Penicillium viridicatum(Accession number:MK583349)的相似度为99％。该序列已经提交Genbank数据库，序列号为：MN100452。
[0052] 综上所述，菌株鉴定为Penicillium sp.，该菌株目前已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2019年08月02日，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.18116。
[0053] 实施例2：化合物1和化合物2的制备方法
[0054] (1)菌株发酵培养
[0055] 切取生长于PDA平板表面的菌株Penicillium sp.TR85(大小2×2cm)，接种至已灭菌的、盛有固体培养基的锥形瓶中，室温静置培养30天。发酵产物经乙酸乙酯反复浸泡提取，合并提取液进行浓缩，获得发酵粗提物。
[0056] 所述固体培养基为每100mL天然海水中加入大米100g，蛋白胨0.6g。
[0057] (2)化合物的制备
[0058] 将上述发酵粗提物进行减压硅胶柱层析(内径65mm，长度300mm，具砂板及抽咀的玻璃层析柱)，按照洗脱液极性递增顺序，以梯度为40:1至1:1(v/v，下同)的石油醚-乙酸乙酯作为溶剂进行梯度洗脱；收集石油醚-乙酸乙酯＝1:1洗脱组分，进行反相硅胶柱层析(内径30mm，长度600mm，具标准四氟节门的玻璃层析柱)，以梯度为2:8至1:0的甲醇-水作为溶剂进行梯度洗脱。
[0059] 收集甲醇-水＝6:4反相硅胶洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为50％甲醇-水，检测波长为220nm，流速为3mL/min，收集保留时间tR值为14.4min的组分，即得化合物1。
[0060] 收集甲醇-水＝8:2反相硅胶洗脱组分，进行半制备高效液相色谱法纯化，流动相为76％甲醇-水，检测波长为220nm，流速为3mL/min，收集保留时间tR值为12.5min的组分，即得化合物2。
[0061] (3)化合物的结构鉴定
[0062] 表1.化合物1的1H(500MHz)和13C NMR(125MHz)
[0063] 谱图数据(NMR测试所用溶剂：氘代氯仿)
[0064]
[0065] 表2.化合物2的1H(500MHz)和13C NMR(125MHz)
[0066] 谱图数据(NMR测试所用溶剂：氘代甲醇)
[0067]
[0068] 化合物1，白色粉末，HR-ESI-MS m/z 289.1741[M+Na]+，提示分子式为C16H26O3，其1H-(附图1)和13C-NMR(附图2)数据见表1。
[0069] 化合物2，淡黄色粉末，HR-ESI-MS m/z 439.2107[M+Na]+，提示分子式为C24H32O6，其1H-(附图3)和13C-NMR(附图4)数据见表2。
[0070] 实施例3：除草活性试验
[0071] 罗小勇等所建立的琼脂混粉法(青岛农业大学学报,2007,24:267-270)用于快速测定化合物的除草活性，具有灵敏度高、操作简便、重复性好、便于大通量筛选等优点，且易于观察指示植物的生长状况。罗小勇等利用该方法对40种园林植物叶片进行了快速除草活性测定。张丽娟(植物保护,2016,42:63-66)和苏范胜(应用化学,2014,31:290-295)以稗草为供试杂草，采用琼脂混粉法快速测定了玉米秸秆和咪唑类化合物的除草活性。张蕴(微生物学报,2015,55:292-298)和Li Shuai(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:8997-9001)以反枝苋为供试杂草，研究了微生物次生代谢产物对反枝苋根生长的抑制作用。
[0074] (2)样品溶液的制备
[0075] 待测化合物以二甲亚砜(DMSO)溶解，配制为4mg/mL溶液，以50％DMSO水溶液稀释成不同浓度，备用。
[0076] (3)试验方法
[0077] 1mL的样品溶液和99mL无菌琼脂水溶液混合均匀，分别倒入3个25mL的小烧杯内冷凝。用尖嘴镊子在已冷凝的琼脂表面插5个小口，分别夹取胚根长达4～5mm的已发芽供试杂草幼苗，将胚根垂直轻轻插入小口中。每烧杯5粒，重复3次。而后将所有烧杯用锡纸封口并置于已消毒的小纸箱内，放人人工气候箱遮光培养2d。人工气候箱的设置条件为14h光照(25℃)和10h黑暗(20℃)的自动循环，箱内的相对湿度为60％。2d后调查胚根和胚轴的长度，计算杂草生长抑制率。
[0078] 计算公式为(中国农学通报,2013,29:177-182)：
[0079] 生长量＝处理后的胚根(胚轴)长度-处理前的胚根(胚轴)长度；
[0080] 抑制率(％)＝[(对照平均生长量-处理平均生长量)/对照平均生长量]×100％。
[0081] 表3.式(一)所示化合物1与化合物2对稗草幼苗胚根的生长抑制率(％)[0082]
[0083] 试验结果见表3，结果表明，在10μg/mL浓度时，化合物1(图5)与化合物2(图6)对稗草(E.crusgalli)幼苗胚根的生长抑制率分别为81.5％与79.6％，显著优于商品化除草剂乙草胺，可作为具有除草活性的先导化合物或新农药成分。
[0084] 实施例4：卤虫致死活性
[0085] 卤虫(Brine shrimp)是一种对有毒物质高度敏感的水生动物，能够作为模式生物初步评价化合物对环境的毒性作用，Masi,M.等应用卤虫初步评价除草活性化合物Colletochlorins E与F的毒性(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2017,65:1124-1130)。
[0086] 1)卤虫卵的孵化
[0087] 取卤虫卵100mg置于500mL烧杯中，加入人工海水400mL，用充气泵缓缓充气，室温孵化24h，除去卵壳及未孵化的卵，卤虫继续培养24h，备用。
[0088] 2)样品溶液的制备
[0089] 待测化合物以DMSO溶解，配制为20mg/mL的母液，并依次二倍稀释至10,5与2.5mg/mL溶液，备用。
[0090] 3)试验方法
[0091] 取96孔细胞培养板，每孔加195μL含10-15个卤虫的人工海水液，制成测试培养板。空白对照组和各浓度样品组各设三个平行孔，空白对照组加5μL人工海水，样品组加5μL不同浓度的样品液。室温培养24小时后，在双目解剖镜下计数卤虫死亡个体数目。
[0092] 卤虫致死活性用校正死亡率表示，计算公式如下：
[0093] 校正死亡率＝(对照组存活率－处理组存活率)/对照组存活率×100％，并计算半数致死率LD50值。
[0094] 试验结果表明：式(一)所示化合物即使在500μg/mL时，也不表现卤虫致死活性。上述结果能够初步表明，式(一)所示化合物对环境的毒性作用较小，具有农业推广的潜力。
[0095] 以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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